Molekyylipatologia, kudos- ja solunäytteiden mutaatiotutkimukset

Lähtömateriaalin edustavuus tutkitaan aina ennen DNA-eristystä HE-värjätyltä leikkeeltä.  Tarvittaessa näytteestä valitaan ja dissekoidaan DNA-eristykseen edustavin kohta jossa syöpäsolujen määrä on mahdollisimman suuri. Näytteen erityisominaisuudet ja määrä otetaan huomioon DNA-eristyksessä ja valittaessa tutkimusmenetelmää. Näytteen edustavuus otetaan huomioon tuloksen tulkinnassa.

9944 Ts-NGSsCa1

Näyte: kudos tai solunäyte.

Menetelmä: Yleisimpien somaattisten syöpämutaatioiden tutkimus tehdään NGS-geenipaneelilla joka sisältää geenialueita 22 eri geenistä:

BRAF-, PDGFRA-, EGFR- (ERBB1), KRAS-, NRAS-, KIT- (CD117), PIK3CA- (p110-alpha), TP53- (p53), ERBB2- (HER-2, NEU), AKT1, ALK, CTNNB1, ERBB3, ESR1 (ERα), FOXL2, GNA11, GNAQ, IDH1, IDH2, MET, RAF1 ja RET

Syöpäpaneeliin on yhdistetty mikrosatelliittialueiden sekvensointiin perustuva MSI-testi. MSI-testauksessa mitataan yhdeksän mirosatelliittilokuksen BAT40(T)37, MONO-27(T)27, BAT26(A)27, NR24(T)23, BAT25(T)25, NR22(T)21, HSP110-T17(T)17, NR21(A)21 ja  BAT34C4(A)18 instabiliteettia. Paksusuolensyövässä MSI tuloksesta annetaan aina lausunto, muissa tapauksissa vain pyydettäessä.

Menetelmässä DNA näytteet pilkotaan,  indeksoidaan eli merkitään uniikeilla merkeillä, tutkittavat alueet monistetaan multiplex PCR reaktiossa ja lopuksi sekvensoidaan Illuminan  NextSeq500 laitteella. NGS-data-analyysi tehdään Qiagenin CLC Genomics workbech -ohjelmassa. Analyysissä data rinnastetaan ihmisen referenssigenomiin (Hg19) ja sille tehdään laatufiltteröintiä. Tuloksien tulkinta tehdään Euformaticsin OmnomicsNGS-ohjelmistolla jossa tapahtuu varianttien annotointi. OmnomicsNGS-ohjelmisto hakee tietoja eri tietokannoista (gnomAD, Civic, Clinvar, Cosmic). Annotoinnin ja populaatiofrekvenssien perusteella datasta valikoidaan raportoitavaksi tunnetut patogeeniset variantit ja myös mahdollisesti patogeeniset variantit jos niiden patogeenisuutta tukee jokin tieto.

Tutkimuksella voidaan määrittää yhden emäksen muutoksia sekä pieniä geenideleetioita ja -insertioita. Tutkimuksella ei voida määrittää translokaatioita tai geenifuusioita.

Tutkimus korvaa aikaisemmin pyrosekvensointi- ja qPCR-menetelmillä mm. paksu- ja peräsuolisyöpänäytteistä tehdyt KRAS-, NRAS-, BRAF-tutkimukset, melanoomanäytteistä tehdyt BRAF-mutaatioanalyysit sekä keuhkosyövän kudosnäytteistä tehdyt EGFR-geenin tutkimukset.

Kaikki yli 5% frekvenssin patogeeniset tai todennäköisesti patogeeniset muutokset raportoidaan.

Tutkimusohje

10101 Ts-NGScomp

Näyte: kudosnäyte, solunäyte, verinäyte.

Menetelmä: Laaja NGS-geenipaneelitutkimus DNA-mutaatioiden osoittamiseksi kudosnäytteestä. Paneeli sisältää 275 geeniä:

ABL1, ACVR1B, AKT1, AKT2, AKT3, ALK, AMER1, APC, AR, ARAF, ARID1A, ARID1B, ARID2, ASXL1, ATM, ATR, ATRX, AURKA, AURKB, AURKC, AXIN1, AXIN2, B2M, BAP1, BCL2, BCL2L1, BCL6, BCOR, BCORL1, BCR, BIRC3, BLM, BRAF, BRCA1, BRCA2, BRIP1, BTK, CALR, CARD11, CBL, CBLB, CBLC, CCND1, CCND3, CCNE1, CD274, CD79A, CD79B, CDC73, CDH1, CDK12, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2C, CEBPA, CHEK1, CHEK2, CIC, CREBBP, CRLF2, CSF1R, CSF3R, CTCF, CTNNA1, CTNNB1, CUX1, CXCR4, CYLD, DAXX, DDR2, DICER1, DNM2, DNMT3A, DOT1L, EED, EGFR, EGLN1, EP300, EPAS1, EPHA3, EPHA5, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERG, ESR1, ETV6, EXO1, EZH2, FAM175A, FAM46C, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FAS, FBXW7, FGF4, FGF6, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FH, FLCN, FLT3, FLT4, FOXL2, FUBP1, GALNT12, GATA1, GATA2, GATA3, GEN1, GNA11, GNAQ, GNAS, GREM1, GRIN2A, H3F3A, HGF, HIST1H3B, HNF1A, HOXB13, HRAS, HSP90AA1, ID3, IDH1, IDH2, IGF1R, IKZF1, IKZF3, IL7R, INHBA, IRF4, JAK1, JAK2, JAK3, KAT6A, KDM5C, KDM6A, KDR, KEAP1, KIT, KMT2A, KMT2B, KMT2C, KMT2D, KRAS, LRP1B, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAP3K1, MAP3K14, MAPK1, MCL1, MDM2, MDM4, MED12, MEF2B, MEN1, MET, MITF, MLH1, MPL, MRE11A, MSH2, MSH6, MTOR, MUTYH, MYC, MYCL, MYCN, MYD88, NF1, NF2, NFE2L2, NFKBIA, NKX2-1, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NPM1, NRAS, NSD1, NTRK1, NTRK2, NTRK3, PAK3, PALB2, PAX5, PBRM1, PDGFRA, PDGFRB, PHF6, PIK3CA, PIK3R1, PIK3R2, PIM1, PLCG1, PMS1, PMS2, POLD1, POLE, PPM1D, PPP2R1A, PRDM1, PRKAR1A, PRKDC, PRSS1, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAC1, RAD21, RAD50, RAD51, RAF1, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, RNF43, ROS1, RUNX1, SDHB, SETBP1, SETD2, SF3B1, SMAD2, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SMC1A, SMC3, SMO, SOCS1, SOX2, SOX9, SPOP, SRC, SRSF2, STAG2, STAT3, STK11, SUFU, SUZ12, TAL1, TCF3, TERT, TET2, TGFBR2, TNFAIP3, TNFRSF14, TP53, TRAF3, TSC1, TSC2, TSHR, U2AF1, U2AF2, VHL, WHSC1, WT1, XPO1, XRCC2, XRCC3, ZNF217 ja ZRSR2.

Menetelmässä DNA-näytteet pilkotaan,  indeksoidaan eli merkitään uniikeilla merkeillä, tutkittavat alueet monistetaan multiplex PCR -reaktiossa ja lopuksi sekvensoidaan Illuminan NextSeq500-laitteella. NGS-data-analyysi tehdään Qiagenin CLC Genomics workbech -ohjelmassa. Analyysissä data rinnastetaan ihmisen referenssigenomiin (Hg19) ja sille tehdään laatufiltteröintiä. Tuloksien tulkinta tehdään Euformaticsin OmnomicsNGS-ohjelmistolla jossa tapahtuu varianttien annotointi. OmnomicsNGS-ohjelmisto hakee tietoja eri tietokannoista (gnomAD, Civic, Clinvar, Cosmic). Annotoinnin ja populaatiofrekvenssien perusteella datasta valikoidaan raportoitavaksi tunnetut patogeeniset variantit ja myös mahdollisesti patogeeniset variantit jos niiden patogeenisuutta tukee jokin tieto.

Tutkimuksella voidaan määrittää yhden emäksen muutoksia sekä pieniä geenideleetioita ja -insertioita. Tutkimuksella ei voida määrittää translokaatioita tai geenifuusioita.

Yli 10% frekvenssin patogeeniset tai todennäköisesti patogeeniset muutokset raportoidaan.

Laajaa geenipaneelia pyydettäessä on tärkeää ilmoittaa mistä geeneistä tutkimuksen pyytäjä on kiinnostunut, koska tutkimus tuottaa satojen, jopa tuhansien varianttien listan jonka läpikäynti yksityiskohtaisesti on aikaavievää ja näin viivästyttää vastausta.

Tutkimusohje

10110 Ts-MLH1met

Näyte: kudosnäyte, solunäyte, verinäyte.

Menetelmä: Menetelmä perustuu julkaistuun menetelmään Bettstetter et al. (2008). Tutkimukseen sisältyy DNA:n eristys ja MLH1-geenin promoottorialueen metylaatioasteen tutkimus metylaatiospesifisiin entsyymeihin ja qPCR-menetelmään perustuen. Tutkimuksella saadaan prosentuaalinen arvo näytteen sisältämän MLH1-geenin promoottorialueen DNA:n metylaatiosta. Bettstetter et al. (2008) mukaisesti metylaation raja-arvona käytetään 16%:a.

Tutkimusta käytetään seulontamenetelmänä selvittämään johtuuko immunohistokemiallisella menetelmällä todettu MLH-1 puutos geenin somaattisesta inaktivoitumisesta vai mahdollisesti perinnöllisestä geenimutaatiosta (Lynchin Syndrooma/HNPCC).

Tutkimusohje

10113 Ts-RNAfuus

Näyte: kudos- tai solunäyte (FFPE tai tuorekudos)

Menetelmä: Yleisimpien somaattisten geenifuusioiden tutkimus tehdään RNA-pohjaisella NGS-geenipaneelilla, joka sisältää geenialueita 39:stä eri geenistä:

ALK, BAG4, BRAF, CCDC6, CD74, CIAO1, COPA, CUX1, EGFR, EML4, ETV6, EZR, FGFR1, FGFR2, FGFR3, GOPC, HIP1, KIF5B, KLC1, LRIG3, MET, MPRIP, MRPS14, NRG1, NTRK1, NTRK2, NTRK3, RAD51, RET, ROS1, SDC4, SLC34A2, STRN, TACC3, TFG, TPM3, TPR ja TRIM33.

Menetelmässä RNA muunnetaan ensin cDNA:ksi,  syntynyt cDNA indeksoidaan eli merkitään uniikeilla merkeillä, tutkittavat alueet monistetaan multiplex PCR reaktiossa, ja lopuksi sekvensoidaan Illuminan  NextSeq500 laitteella. NGS-data-analyysi tehdään Qiagenin CLC Genomics workbech -ohjelmassa.

Tutkimuksella voidaan määrittää translokaatioita tai geenifuusioita paneelin kattamilta geenialueilta. Menetelmä tunnistaa myös ennalta määrittelemättömiä/uusia geenifuusioita, mikäli toinen fuusiopartnereista kuuluu paneeliin. Menetelmä tunnistaa myös eksonien skipping muutoksia (esim MET eksoni 14). Paneeli on suunniteltu erityisesti keuhkosyövässä esiintyvien geenifuusioiden tutkimiseen.

Tutkimusohje