Molekyylipatologia, menetelmät

Uuden sukupolven sekvensointi (Next Generation Sequencing, NGS)

Uuden sukupolven sekvensointi eli massiivinen paralleeli sekvensointi tarkoittaa miljoonien DNA-pätkien samanaikaista sekvensointia. Menetelmä soveltuu yhden nukleotidin muutosten sekä lyhyiden insertioiden ja deleetioiden tutkimiseen. Menetelmällä voidaan määrittää kaikki halutun alueen muutokset, ei vain ennalta määriteltyjä mutaatioita.

Ennen sekvensointia, näytteestä eristetään DNA ja sen määrä mitataan ja siitä valmistetaan geenikirjasto. Geenikirjaston valmistelussa genominen DNA pilkotaan sopivan kokoisiksi pätkiksi, jonka jälkeen halutut kohdealueet tai kohdegeenit rikastetaan PCR-tekniikalla ja samalla näytteeseen lisätään uniikit tunnistussekvenssit sekä sekvensoinnin mahdollistavat adapterit.

Sekvensointi suoritetaan Illuminan NextSeq500-laitteilla, joka käyttää Sequencing by Synthesis (SBS) -kemiaa. Koska näytteisiin on lisätty uniikit tunnistussekvenssit, voidaan sekvensointiin laittaa useiden kymmenien tai jopa satojen potilaiden näytteet samanaikaisesti. Sekvensoinnin jälkeen potilaiden DNA-sekvenssit erotellaan tunnistussekvenssien avulla. DNA-sekvenssit käyvät läpi monimutkaisen datan käsittelyprosessin, jonka aikana potilaan DNA-sekvenssit rinnastetaan ihmisen referenssigenomiin. Tuloksena saadaan varianttilista joka kertoo jokaisen sekvenssikohdan jossa näytteen DNA eroaa ihmisen referenssisekvenssistä. Koska jokaisen yksilön DNA-sekvenssi on aina ainutlaatuinen eikä vastaa täysin referenssisekvenssiä, tulos sisältää myös normaaleja testattavalle yksilölle ominaisia DNA-jaksoja jotka täytyy tulosten tulkinnassa suodattaa pois. Tulosten tulkinnan apuna käytetään erilaisia tietokantoja (1000 genomes, gnomAD, Cosmic, Clinvar, Civic, IARC, SISU).

Reaaliaikainen PCR (qPCR tai RT-PCR)

PCR eli polymeraasiketjureaktio (polymerase chain reaction) on menetelmä, jolla monistetaan DNA-molekyylejä. PCR mahdollistaa yksittäisen DNA-molekyylin monistamisen miljooniksi samanlaisiksi kopioiksi jolloin niiden mittaaminen on mahdollista. Kary Mulliksen 1983 keksimä tekniikka on lukuisine versioineen nykyisin yleisesti käytössä biologian ja lääketieteen alan laboratorioissa. Reaaliaikaisessa PCR-reaktiossa (RT-PCR/qPCR) DNA:n monistumista voidaan seurata reaaliajassa fluoresenssin avulla.

Digitaalinen PCR (dPCR)

Digitaalinen PCR on tavallisen PCR-tekniikan muunnos jonka suurin ero on DNA-määrän mittaustavassa. Digitaalisen PCR-menetelmän etuja on mm. kvantitointi ilman standardikäyrää, joka tekee mittauksesta paljon tarkemman. Menetelmä on myös vähemmän herkkä PCR-reaktiota estävien aineiden vaikutukselle.  Digitaalisessa PCR-tekniikassa reaktiot jaetaan kymmeniin tuhansiin erillisiin reaktioyksiköihin. Reaktiossa on leimatut mutaatiospesifiset koettimet ja toiset koettimet villityypin (normaali) DNA:lle. PCR-reaktion jälkeen erillisten reaktioiden fluoresenssi mitataan. Reaktion herkkyyteen vaikuttavat käytettyjen koettimien spesifisyys ja DNA-määrä. Mitä suurempi määrä DNA:ta reaktiossa sitä suuremmalla varmuudella voidaan mutaatio osoittaa näytteestä.